《动物血涂片制备操作规程》

动物血涂片制备操作规程.pdf本文件为T/CVMA 69-2021《动物血涂片制备操作规程》，由中国兽医协会发布并即时实施，适用于动物诊疗机构医务人员，明确了血涂片和淡黄层涂片的制备材料、操作步骤，规定可采用瑞氏-姬姆萨、迪夫、Diff-Quik、新亚甲蓝四种染色法及对应操作，同时从大体评估和显微镜100倍放大两个维度制定了涂片质量评估标准，还对各操作环节的注意事项做了详细规范。

思维导图

## 标题: T/CVMA 69-2021动物血涂片制备操作规程
- 基础信息
  - 发布实施：2021-12-22
  - 归口单位：中国兽医协会
  - 适用主体：动物诊疗机构医务人员
  - 核心内容：制备、染色、质量评估
- 术语和定义
  - 血涂片：薄层血膜，用于形态诊断
  - 抗凝剂：防止血液凝固的试剂/物质
  - 新鲜全血：未抗凝、未凝固的新鲜血液
  - 淡黄层：血浆与红细胞间，白细胞/血小板集中区
- 血涂片制备
  - 推片法
    - 材料：新鲜全血/EDTA抗凝血、磨砂边载玻片等
    - 步骤：滴血→30°~45°推片→风干→标记，血膜长1/2~2/3载玻片
  - 淡黄层涂片
    - 材料：EDTA抗凝血、毛细管、毛细管离心机等
    - 步骤：吸凝血→密封→10000g离心5min→切割→制膜→风干→标记
- 染色方法
  - 罗曼诺夫斯基染色法：瑞氏-姬姆萨、迪夫、Diff-Quik
  - 特殊染色：新亚甲蓝染色（适用于血涂片/EDTA抗凝血）
  - 各方法含：材料、操作步骤、专属注意事项
- 质量评估
  - 大体评估：血膜均匀、有羽状尾、染色无差异等
  - 显微镜评估（100倍）：细胞分布均匀、完整，染色显色正常
- 附录规范
  - 附录A：瑞氏-姬姆萨染色（规范性）
  - 附录B：迪夫快速染色（滴染/浸染，规范性）
  - 附录C：Diff-Quik染色（规范性）
  - 附录D：新亚甲蓝染色（规范性）

详细总结

本文件为中国兽医协会发布的T/CVMA 69-2021《动物血涂片制备操作规程》，2021年12月22日发布并同步实施，依据GB/T 1.1-2020起草，适用于动物诊疗机构医务人员开展血涂片制备、染色及质量评估工作，无规范性引用文件，核心包含术语定义、涂片制备、染色、质量评估四大核心模块及四项规范性附录。

一、术语和定义

明确4个核心术语的定义，为后续操作提供概念依据：

血涂片：将血液制成薄层血膜用于形态诊断的样本；
抗凝剂：通过物理/化学方式防止血液凝固的试剂/物质；
新鲜全血：新鲜采集、未抗凝且未凝固的血液；
淡黄层：抗凝血液离心后血浆与红细胞间的分层，是白细胞、血小板集中区域。

二、血涂片的制备

分推片法和淡黄层涂片两种制备方式，均明确材料和标准化操作步骤，核心数字和要求如下：

（一）推片法制备血涂片

准备材料：新鲜全血/EDTA抗凝血、带磨砂边载玻片、盖玻片、检查手套、不易洗脱记号笔/铅笔；
操作关键：距磨砂边1 cm滴血，推片与载玻片呈30°~45°夹角，血液浓稠则减小角度、缓慢推片，稀薄则加大角度、快速推片；血膜长度为载玻片的1/2~2/3，自然风干后标记。

（二）淡黄层涂片的制备

准备材料：EDTA抗凝血、毛细管、黏土密封剂、医用砂轮、毛细管离心机等；
操作关键：毛细管吸凝血至管腔2/3~4/3，密封剂插入长度≥4 mm，10000 g离心5 min，在红细胞与淡黄层交接处1 mm~2 mm切割毛细管，制膜时避免挤压样本，自然风干后标记。

三、染色

涂片可选用罗曼诺夫斯基染色法（瑞氏-姬姆萨、迪夫、Diff-Quik），血涂片/EDTA抗凝血还可采用新亚甲蓝染色，各方法的核心操作和参数见下表，且均有专属注意事项：

染色方法	核心操作要点	关键时间参数
瑞氏-姬姆萨染色	染液覆盖染色1min，加2~3倍磷酸盐缓冲液混匀后再染色，蒸馏水轻冲	基础染色1min，后续染色3~10 min
迪夫快速染色-滴染法	先滴A液染色，冲净后滴B液染色，蒸馏水冲洗	A、B液各染色20~30 s
迪夫快速染色-浸染法	依次浸入A液、磷酸盐缓冲液、B液，小幅度移动玻片，蒸馏水冲洗	A、B液各浸染20~30 s，缓冲液中移动8~10次
Diff-Quik染色	依次浸入A液固定、B液和C液染色，流动水冲洗	A液固定10~20 s，B/C液各染色5~10 s
新亚甲蓝染色	抗凝血与染液混匀后室温静置，再用推片法制片	静置≥20 min

四、质量评估

分大体评估和显微镜评估两个维度，显微镜评估需在100倍放大下进行，任一维度不达标则需重新制备涂片：

大体评估：血液样本全在涂片上；血膜均匀无空泡/划痕，推片法涂片有火焰状羽状尾；染色后无明显色差，罗曼诺夫斯基染色呈蓝至紫红色，新亚甲蓝染色呈淡蓝色；
显微镜评估（100倍）：推片法涂片血细胞分布均匀、有足够单细胞层，白细胞不聚集于尾部；淡黄层涂片中央厚、四周薄，有足够单细胞层；细胞完整无显著破裂；罗曼诺夫斯基染色红细胞呈橘红至粉红色、白细胞核呈不同程度蓝色，新亚甲蓝染色红细胞呈淡绿色、白细胞核/颗粒及血小板颗粒呈蓝色。

五、规范性附录

共4项附录，均为规范性要求，分别对应四种染色方法，详细规定了各染色法的准备材料、操作步骤和注意事项，核心注意事项包括：涂片需完全风干、根据涂片厚薄/细胞数量/温度调整染色时间、避免染液蒸发产生沉淀、不可用吸水纸直接吸取涂片水分等。

关键问题

问题：推片法制备动物血涂片时，推片角度和速度该如何根据血液状态调整？
答案：推片与载玻片保持30°~45°夹角，若血液稀薄，需加大二者角度并快速推片；若血液浓稠，需减小二者角度并缓慢推片，同时推片时不可垂直施力、不可过早离开载玻片表面。
问题：动物血涂片及淡黄层涂片的质量评估分哪两个维度，显微镜评估的放大倍数要求是多少？
答案：质量评估分为大体评估和显微镜评估两个维度，其中显微镜评估需在100倍放大下进行，两个维度任一条件不满足，涂片均需舍弃并重新制备。
问题：迪夫快速染色有哪两种操作方法，二者的核心区别是什么？
答案：迪夫快速染色分为滴染法和浸染法；核心区别在于操作方式，滴染法是直接将迪夫A、B液逐滴滴加在涂片表面染色，浸染法是将涂片浸入装有染液和缓冲液的染色缸中完成染色；且涂片含易脱落成分时，不可使用浸染法。